大鼠8异前列腺素 (ELISA)试剂盒 |
大鼠8异前列腺素 (ELISA)试剂盒
实验条件的选择
在 ELISA 中,选择各种实验条件很重要,包括:
(1)固相载体的选择:许多物质都可以用作固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、纤维素等。可以是孔板、试管、珠子等形式,常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。无论是何种载体,使用前都可以进行筛选:包被等量的抗原,在相同的实验条件下进行反应。
(2)包被抗体(或抗原)的选择:当抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度较好,一般要求pH在9.0~9.6之间在吸附过程中。吸附温度、时间和蛋白质的量也有一定的影响,一般4℃18~24小时。蛋白质包被的最佳浓度需要进行滴定:即在包被不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)后,在其他测试条件相同的情况下观察阳性样品的OD值.选择 OD 值最高、蛋白质含量最少的浓度。对于大多数蛋白质,通常为 1-10 μg/ml。
(3)酶标抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法滴定初始效价(见酶标抗体部分)。然后固定其他条件或采用“方阵法"(包被材料、待测样品对照品和酶标抗体处于不同稀释度)在正式实验系统中准确滴定工作浓度。
(4)酶底物和氢供体的选择:氢供体的选择要求便宜、安全、显色反应明显,但本身是无色的。一些供氢体(如OPD等)具有潜在的致癌作用,应予以保护。有条件的应选用非致癌、高灵敏度的供氢体,如TMB、ABTS等,都是比较满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱停止。一般底物作用时间为10-30分钟。底物溶液必须新鲜配制,特别是在使用前应立即加入 H2O2。
主要设备
试剂
(1) 包被缓冲液(pH9.60.05M 碳酸盐缓冲液):
Na2CO3 1.59g
碳酸氢钠 2.93g
加入蒸馏水至 1000ml
(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS):0.15M
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4 12H2O 2.9g
氯化钠 8.0g
0.2g
Tween-20 0.05% 0.5ml
加入蒸馏水至 1000ml
(3) 稀释剂:
牛血清白蛋白 (BSA) 0.1 克
加入洗涤缓冲液至 100ml
或用山羊血清、兔血清等血清和洗涤液补足5-10%。
(4) 终止液(3M H2SO4):
滴加蒸馏水178.3ml、浓硫酸(98%)21.7ml。
(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):
0.2MNa2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml
0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml
加入 50ml 蒸馏水。
(6)TMB(四甲基联苯胺)溶液:
TMB(10mg/5ml 无水乙醇)0.5ml
底物缓冲液 (PH5.5) 10ml
0.75%H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:
ABTS 0.5mg
底物缓冲液 (PH5.5) 1ml
3%H2O2 2μl
(8)抗原、抗体和酶标抗体。
(9)正常人血清和阳性对照血清。
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